基本原理:凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。
层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质,多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质,小分子物质能进入其内部,流下时路程较长,而大分子物质却被排除在外部,下来的路程短,当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时,溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
凝胶层析的特点:
1)凝胶层析操作简便,所需设备简单。有时只要有一根层析柱便可进行工作。分离介质——凝胶完全不需要像离子交换剂那样复杂的再生过程便可重复使用。
2)分离效果较好,重复性高。最突出的是样品回收率高,接近100%。
3)分离条件缓和。凝胶骨架亲水,分离过程又不涉及化学键的变化,所以对分离物的活性没有不良影响。
4)应用广泛。适用于各种生化物质,如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。分离的分子量范围也很宽,如Sephadex G类为102-105 D;Sepharose类为105-108 D。
以上内容参考:百度百科-凝胶过滤层析
⑴脱盐
:高分子(如蛋白质、核酸、多糖等)溶液中的低分子量杂质,可以用
凝胶层析
法除去,这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱长与直径之比为5-15,样品体积可达柱床体积的25%-30%,为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上,一般用
醋酸铵
等挥发性盐类
缓冲液
使层析柱平衡,然后加入样品,再用同样缓冲液洗脱,收集的洗脱液用
冷冻干燥
法除去挥发性盐类。
⑵
用于
分离提纯
:凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对
热原
有较强的吸附力,可用来去除无离子水中的致热原制备
注射用水
。
⑶
测定高分子物质的分子量:用一系列已知分子量的
标准品
放入同一凝胶柱内,在同一条件下层析,记录每一种成分(已知分子量的标准品)的洗脱体积,并以洗脱体积对分子量的对数作图,在一定分子量范围内可得一直线,即分子量的
标准曲线
。测定未知物质的分子量时,可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗脱后,根据物质的洗脱体积,在标准曲线上查出它的分子量。
⑷
高分子溶液
的浓缩:通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中,这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中,而高分子物质则
排阻
在凝胶颗粒之外,再经离心或过滤,将
溶胀
的凝胶分离出去,就得到了浓缩的高分子溶液。
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